Nueva técnica para secuenciar el genoma de la viruela del mono

Representación abstracta del virus de la viruela del mono.

Una nueva técnica permite secuenciar el genoma del virus causante de la viruela del mono en solo 18 horas

 

Investigadores del Centro Conjunto Brasil-Reino Unido para el Descubrimiento, el Diagnóstico, la Genómica y la Epidemiología de Arbovirus (CADDE) concluyeron en tan solo 18 horas la secuenciación completa del genoma del virus monkeypox (MPXV) aislado en el primer paciente con el diagnóstico de viruela símica confirmado en Brasil.

 

AGENCIA FAPESP/DICYT

Este logro fue posible merced a la adaptación al MPXV de una técnica de metagenómica rápida desarrollada durante el doctorado de Ingra Morales Clarobecaria de la FAPESP. Y el trabajo estuvo coordinado por Ester Sabino, docente de la Universidad de São Paulo (USP), en Brasil. Sabino también estuvo al frente de la primera secuenciación del SARS-CoV-2 en el país, en marzo de 2020, y de la de los primeros casos de la nueva variante gamma, surgidos en la ciudad de Manaos alrededor de un año después (lea más en: agencia.fapesp.br/32671 y agencia.fapesp.br/35426/).

El equipo del CADDE dio a conocer estos resultados el pasado 9 de junio en virological.org, un sitio web donde virólogos de todo el mundo comparten información sobre patógenos de interés en tiempo real.

La metodología que desarrollamos es en promedio un 45 % más rápida que las técnicas de metagenómica convencionales. Y su costo también es menor

“Recibimos la muestra de un paciente internado en el Hospital Emílio Ribas a las 16 del martes [7/6] y a las 10 de la mañana siguiente el genoma del virus, que posee casi 200 mil pares de bases [muchas más que las 30 mil del SARS-CoV-2], estaba secuenciado y analizado. La metodología que desarrollamos es en promedio un 45 % más rápida que las técnicas de metagenómica convencionales. Y su costo también es menor: puede llegar a los 30 dólares por muestra”, comenta Morales Claro.

Tal como lo explica Sabino, los científicos suelen recurrir a análisis metagenómicos cuando deben identificar un nuevo virus emergente (como en el caso del SARS-CoV-2 en 2019) o detectar en muestras de pacientes un virus ya conocido sin contar con los reactivos específicos necesarios (como ocurre ahora con el MPXV). Sucede que el test de RT-PCR, el patrón oro en el diagnóstico del COVID-19 y de varias otras enfermedades, requiere de los denominados primers (iniciadores, cebadores), que son secuencias de nucleótidos complementarias a las secuencias virales que ponen en marcha la replicación del material genético. Y el resultado después debe compararse con controles negativos y positivos.

“Cuando surge una epidemia ocasionada por un agente infeccioso nuevo, uno de los grandes cuellos de botella a la hora de diagnosticar los casos es la carencia de primers específicos y de controles positivos. Esta técnica puede ser útil en esas situaciones, pues permite identificar patógenos aún desconocidos, para los cuales no existen reactivos”, explica Sabino. Y cuanto más tempranamente se concrete la detección del caso “índex” (el primer caso), mayor es la probabilidad de contención de un virus emergente, añade Morales Claro.

Cuanto más tempranamente se concrete la detección del caso “índex” (el primer caso), mayor es la probabilidad de contención de un virus emergente, añade Morales Claro

En el caso de la metagenómica, se emplean primers aleatorios (no específicos para un determinado virus o una determinada bacteria), que permiten secuenciar todo el material genético contenido en una muestra biológica, incluso el del hospedante (humano, en este caso) y de otros patógenos que eventualmente albergue. Luego se analiza esa información mediante el empleo de técnicas de bioinformática y se las compara con un panel de referencias. “Exactamente como se lo hizo con el MPXV. Los datos obtenidos se mapearon en una secuencia del virus ya disponible para la realización de estudios. Y esto nos permitió comprobar que se trataba del monkeypox”, dice Morales Claro.

 

Para cortar camino

La confirmación oficial del primer caso de viruela del mono en Brasil se concretó el día 9 de junio en el Instituto Adolfo Lutz (IAL), un laboratorio de referencia del estado de São Paulo en lo que hace al monitoreo epidemiológico. El IAL llevó a cabo el análisis metagenómico en una plataforma conocida como Illumina, una de las tecnologías que se han empleado para detectar el MPXV en los centros europeos y estadounidenses y que está considerada como el patrón oro. La secuenciación mediante este método tarda en promedio 48 horas.

En tanto, el grupo del CADDE empleó un secuenciador portátil conocido como MinION, de la empresa Oxford Nanopore Technologies, y realizó adaptaciones en el protocolo utilizado para secuenciar el virus del Zika (a partir del año 2015) y el SARS-CoV-2 (a partir del año 2020), a los efectos de dotarlo de una mayor rapidez. “Una de las ventajas de este nuevo protocolo reside en la disminución del tiempo de preparación de la muestra para su secuenciación, que pasa de 14 horas a cinco horas con 40 minutos”, informa Morales Claro.

Como el índice de error es un poco más elevado que el de la plataforma Illumina, el equipo del CADDE procuró generar hasta 300 lecturas (reads) redundantes por cada área del genoma viral. “Cuando cubrimos diversas veces la misma región y arribamos al mismo resultado, podemos estar seguros de que no se trata de un error de lectura”, dice la investigadora.

“Una de las ventajas de este nuevo protocolo reside en la disminución del tiempo de preparación de la muestra para su secuenciación, que pasa de 14 horas a cinco horas con 40 minutos”, informa Morales Claro

El siguiente paso consistió en montar el árbol filogenético del MPXV aislado en Brasil. Para ello el equipo del CADDE comparó la secuencia obtenida en la USP con otras 102 dadas a conocer este año por científicos de países tales como Bélgica, Portugal, el Reino Unido, Alemania, España y Estados Unidos. El objetivo consistió en medir el grado de similitud existente entre las secuencias, cosa que suministra pistas acerca de las relaciones evolutivas.

“Bajamos todos los genomas completos secuenciados en 2022 [hasta el día 9/6], alineamos las secuencias y montamos el árbol filogenético. Observamos que el MPXV detectado acá se encaja en un gran clado [grupo], el mismo en el que están los virus secuenciados en Europa y en Estados Unidos. Cuando lo comparamos con el genoma de referencia del CDC [el Centro de Control de Enfermedades de Estados Unidos], actualizado en mayo, observamos solamente tres mutaciones”, comenta Morales Claro. A modo de comparación, el primer genoma de MPXV secuenciado en 2022 exhibió 47 mutaciones con relación al último caso descrito hasta este año (en 2018, en África).

“Qué representan estas mutaciones y si de alguna manera contribuyeron al aumento de la cantidad de casos es algo que aún están estudiando otros grupos de investigación. Acá en el CADDE estaremos con la mira puesta en los próximos casos. La idea es seguir secuenciando para monitorear la evolución del virus”, revela Morales Claro.

Si bien se lo conoce porque causa la viruela del mono o viruela símica, el MPXV es un virus que infecta principalmente a roedores en África. Este patógeno integra el género Orthopoxvirus, el mismo del virus de la viruela humana, erradicada en 1980.

La viruela símica generalmente comienza con fiebre, fatiga, dolor de cabeza y dolores musculares, es decir, con síntomas inespecíficos y similares a los de un refrío o de una gripe. Tras algunos días del comienzo de la fiebre aparecen las lesiones en la piel, que contienen una alta carga viral. La propagación se produce mediante el contacto directo con las heridas o con la ropa, las sábanas y las toallas usadas por alguien que tiene las referidas lesiones en la piel. También puede concretarse a través de la tos o de los estornudos de personas infectadas.

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